Teknik RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) adalah suatu sistem deteksi molekuler yang berbasis PCR, salah satu teknik molekuler untuk mendeteksi keragaman DNA didasarkan pada penggandaan DNA (Waugh and Powell, 1992). RAPD juga merupakan penanda DNA yang memanfaatkan primer acak oligonukleotida pendek untuk mengamplifikasi DNA genom organisme (Pharmawati, 2009).

Prinsip teknik RAPD didasarkan pada kemampuan primer menempel pada cetakan DNA. Primer yang didesain berupa primer tunggal pendek agar dapat menempel secara acak pada DNA genom organisme. Dengan demikian akan terdapat banyak pola fragmen DNA. Perbedaan ini dapat dilihat dengan adanya pola pita pada gel agarosa setelah diwarnai dengan pewarnaan DNA seperti etidium bromide (Waugh and Powell, 1992).

Disamping ditentukan oleh ada tidaknya situs penempelan primer, keberhasilan teknik ini ditentukan juga oleh kemurnian dan keutuhan DNA cetakan. DNA cetakan yang tidak murni akan mengganggu penempelan primer pada situsnya dan akan menghambat aktifitas enzim DNA polimerase. Enzim ini berfungsi untuk melakukan polimerisi DNA. Sedangkan DNA cetakan yang banyak mengalami fragmentasi dapat menghilangkan situs penempelan primer (Nanda et. al., 2004).

Data pita DNA hasil RAPD umumnya dianalisis dengan mengubah menjadi data biner satu dan nol berdasarkan ada atau tidak adanya pita. Primer acak yang digunakan jumlahnya dapat banyak dan tidak terbatas sehingga data biner yang terbentuk berupa matriks biner peubah ganda (Azrai, 2005).

Metode standar RAPD menggunakan oligonukleotida tunggal pendek (10-12 basa) dengan urutan acak sebagai primer untuk mengamplifikasi genomik DNA dalam jumlah nanogram dengan temperatur annealing yang rendah. Produk amplifikasi PCR dipisahkan dengan gel agarose diwarnai dengan ethidium bromide. Primer decamer secara komersial tersedia diberbagai sumber (misalnya Operon Technologies Inc., Alameda, California atau University of British Columbia, Canada) (Triwibowo, 2006).

Analisis RAPD berbeda dengan kondisi PCR standar dimana hanya menggunakan satu primer dan tidak memerlukan informasi sekuen DNA awal. RAPD dapat digunakan untuk berbagai bidang di antaranya mendeteksi keanekaragaman, hubungan antar filogenetik, identifikasi dan perifikasi galur, kesehatan dan epidemiologi, teknologi pangan dan ekologi molekuler, juga dapat digunakan untuk penelitian bakteri, jamur, alga, serangga, tanaman dan manusia (Azrai, 2005).

Menurut Arif et al. (2010), RAPD memiliki kelebihan sebagai berikut :

1. Digunakan secara umum, karena DNA apa saja yang sama dapat dikelompokkan tanpa perlu mengetahui urutan DNA-nya.
2. Sederhana, yang berbeda dengan AFLP atau sidik jari DNA secara tradisional, dimana RAPD tidak memerlukan DNA dalam jumlah besar, atau banyak bekerja dengan pipet, dan tidak memerlukan tenaga yang besar.
3. Cepat, karena hanya memerlukan waktu 6-8 jam.
4. Pengetahuan latar belakang genom organisme tidak diperlukan.
5. Hasil RAPD dapat diperoleh secara cepat terutama jika dibandingkan dengan analisis RFLP yang memerlukan banyak tahapan.
6. Beberapa jenis primer arbitrary dapat dibeli dan digunakan untuk analisis genom semua organism.
7. Literatur lain menambahkan kelebihan RAPD antara lain hemat biaya, mudah dipelajari, primer yang diperlukan sudah banyak dikomersilkan sehingga mudah diperoleh (Waugh and Powell, 1992).
8. RAPD mempunyai keterbatasan yaitu tidak dapat membedakan individu homozigot dan heterozigot karena bersifat sebagai penanda dominan, dan sangat sensitif terhadap perubahan kondisi reaksi PCR (Arif et al., 2010).
9. RAPD memiliki tingkat reproduksibilitas pola marka dari laboratorium ke laboratorium berbeda dan memerlukan konsentrasi primer dan kondisi siklus suhu yang optimal pada saat pengujian (Waugh and Powell, 1992).