Kloning

Kloning Gen (Sumber : www.edumedia-sciences.com)

Kita sekarang hidup di era revolusi teknologi. Melalui Biologi molekulerperkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang science mengalami revolusi yang sangat pesat.

Kloning gen merupakan suatu terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang mungkin sangat dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning gen meliputi serangkaian proses isolasi fragmen DNA spesifik dari genom suatu organisme, penentuan sekuen DNA, pembentukan molekul DNA rekombinan, dan ekspresigen target dalam sel inang.

Penentuan sekuen DNA melalui sekuensing bertujuan untuk memastikan fragmen DNA yang kita isolasi adalah gen target sesuai dengan kehendak kita. Gen target yang kita peroleh selanjutnya kita klon dalam sebuah vektor (plasmid, phage ataucosmid) melalui teknologi DNA rekombinan yang selanjutnya membentuk molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan yang dihasilkan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya sel bakteri, misalnya strain E. coli) untuk diproduksi lebih banyak. Gen-Gen target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan mengahsilkan produk gen yang kita inginkan.

Kloning Gen (http//:tainano.com)

Aplikasi kloning gen yang sudah pernah kita dengar adalah produksi insulindengan pendekatan kloning gen. Fragmen DNA spesifik penyandi insulin kita isolasi dan diklon dalam suatu vektor  membentuk DNA rekombinan yang selanjutnya produksi insulin dilakukan di dalam sel inang bakteri E. coli.

Teknik kloning gen

Tujuan Kloning Gen

§   Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut 

§   Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut 

§   Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut 

§   Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan 

§   Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk Diklon

§   DNA kromosom 

§   cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

§   DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Bahan / Alat untuk Mengklon

§   Enzim endonuklease restriksi 

§   Enzim ligase 

§   Vektors 

§   Inang (Host)

§   Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Mekanisme Penyisipan Gen/DNA 

1.    DNA yang ingin disisipkan, diisolasi, dan dipotong oleh enzim endonuklease restriksi, di tempat yang urutan nukleotidanya spesifik.

2.    DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli, diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya disebut sebagai vektor pengklon.

3.    Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh enzim endonuklease ligase.

4.    Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri, kemudian bakteri tersebut dikembangbiakkan menjadi banyak sehingga rekombinan pun ikut bertambah banyak, demikian pula hasil ekspresi gennya.