Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Suranto, 2002). Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan meletakkannya pada suatu medan listrik (Tchin et al., 2011).

Elektroforesis memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif (Suranto, 2002). Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein. Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan asam amino (Andrews, 1993).

Menurut Andrews (1993), lektroforesis merupakan teknik yang umum digunakan untuk analisis DNA dan protein. Melalui teknik ini dapat ditentukan:

1. Berat molekul suatu bahan

2. Banyaknya jenis protein pada suatu sampel

3. Adanya pemalsuan bahan atau kerusakan/kontaminasi bahan

4. Adanya antibodi terhadap virus atau bakteri pathogen tertentu

5. Titik isoelektrik protein

Hartati dan Lisdiyati (1997) menyebutkan terdapat dua macam macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal maupun vertikal. Sedangkan menurut Suranto (2002), berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:

1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.

2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarosa atau poliakrilamid.

Peralatan untuk elektroforesis secara umum terdiri dari 2 komponen utama, yaitu power supply sebagai sumber arus listrik dan tangki elektroforesis. Untuk menghantarkan listrik, gel diletakkan dalam suatu bufer. Bufer yang sama digunakan untuk membuat gel (Tchin et al., 2011). Untuk pewarnaan digunakan Ethidium Bromida, suatu zat pewarna yang dapat menyisip/interkalasi di antara basa DNA pada dua utas DNA yang berlainan. Ethidium Bromida (EtBr) akan berpendar di bawah paparan sinar UV (Lepais and Bacles, 2011). Pewarna ini dapat ditambahkan pada gel dan bufer sehingga tidak perlu melakukan staining sesudah proses elektroforesis. Keuntungannya adalah lebih praktis, tetapi kemungkinan kontaminasi EtBr lebih besar. EtBr adalah zat yang bersifat karsinogenik sehingga harus dihindari kontak langsung (Andrews, 1993).

Untuk analisis DNA gel yang digunakan adalah agarosa, suatu polisakarida (Allen et al., 1984). Elektroforesis yang dilakukan adalah sistem horizontal. DNA yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah kutub positif melalui molekul-molekul agarosa (Hartati dan Lisdiyati, 1997). Selain agarosa, gel poliakrilamid juga dapat digunakan untuk memisahkan DNA, terutama untuk fragmen yang berukuran kecil (antara 5 bp-<1 kb), misalnya untuk sekuensing (Lepais and Bacles, 2011). Laju migrasi DNA pada agarosa dipengaruhi oleh beberapa faktor:

1. Arus listrik

Semakin besar arus listrik yang digunakan, laju migrasi akan semakin cepat. Akan tetapi jika arus yang digunakan besar, akan menimbulkan panas yang dapat menyebabkan gel meleleh (Suranto, 2002).

2. Konsentrasi gel

Konsentrasi agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori gel yang akan memisahkan DNA. Untuk mendapatkan resolusi yang tinggi digunakan konsentrasi agarosa yang lebih tinggi. Agarosa umumnya dipakai dalam konsentrasi antara 1%-3%. Berikut adalah konsentrasi agarosa yang harus digunakan untuk memisahkan DNA berukuran tertentu menurut (Allen et al., 1984):

Tabel 1. Konsentrasi agarosa dalam pemisahan DNA berdasarkan ukuran (kb)

 

Agarose %                             Kisaran Pemisahan DNA linear (kb)

0,3                                                                   5,0-60

0,6                                                                   1,0-20

0,7                                                                   0,8-10

0,9                                                                   0,5-7

1,2                                                                   0,4-6

1,5                                                                   0,2-4

2,0                                                                   0,1-3

3. Ukuran molekul

Molekul yang berukuran lebih kecil akan lebih mudah melalui pori-pori gel sehingga laju migrasinya lebih cepat. Tetapi ini hanya berlaku untuk fragmen yang berukuran antara 0,5-15 kbp dan bila konformasinya sama. Kecepatan migrasi akan berbanding terbalik dengan log 10 dari jumlah pasangan basa (Lepais and Bacles, 2011).

4. Bentuk molekul

DNA dapat memiliki beberapa kemungkinan bentuk, yaitu supercoil (SC), sirkular (S), linear (L). Laju migrasi masing-masing dari yang paling cepat adalah SC > L > S. Untuk SC dan S, laju migrasinya lebih ditentukan oleh bentuk molekul daripada ukurannya (BL Tchin et al., 2011).

5. ssDNA (single stranded DNA) lebih cepat migrasinya dibandingkan dengan dsDNA (double stranded DNA) yang berukuran sama (Tchin et al., 2011).

6. Arah medan listrik

Molekul DNA akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya jika medan listrik tetap/konstan. Jika arah medan listrik diubah, molekul yang besar akan membutuhkan waktu yang lebih lama untuk reorientasi. Elektroforesis dengan mengubah arah medan listrik secara periodik dikenal dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) (Andrews, 1993).

7. Adanya Ethidium Bromida (EtBr) di dalam gel

Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15% (Lepais and Bacles, 2011).

8. Komposisi Larutan Bufer

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik menjadi sedikit dan migrasi DNA sangat lambat, sedangkan larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik akan menjadi sangat maksimal (Tchin et al., 2011).