Isozym Native

4.    Analisis Pola Pita Isozim

a.     Pembuatan Buffer

Buffer yang digunakan dalam elektroforesis ini dibuat berdasarkan Suranto (2000, 2002). Adapun cara pembuatannya adalah sebagai berikut:

1)    Tank Buffer (buffer boraks), dibuat dengan melarutkan asam boraks 14,4 gram dan boraks 31,5 gram dalam akuades hingga mencapai volume 2 liter.

2)    Buffer ekstraksi, dibuat dengan melarutkan 0,018 gram sistein, 0,021 gram asam askorbat, dan 5 gram sukrosa dalam 20 ml tank buffer pH 8,4.

b.    Pembuatan Larutan Stok

Untuk menyiapkan gel akrilamid, terlebih dahulu dibuat larutan stok berdasarkan Suranto (2000, 2002) yaitu:

1)    Larutan Stock A : 4,5 gram TRI (Hydroxymethyl) Methylamine (PURISS), 0,51 gram Asam Sitrat dan 500 ml aquabides.

2)    Larutan Stock B : 30 gram Akrilamid;0,80 gram N N’ Methylene-bis-acrilamid dan 100 ml aquabides.

3)    Loading dye: Untuk membuat loading dye, 50 μl bromphenol blue dilarutkan ke dalam 200 μl akuades, kemudian ditambah dengan 250 μl gliserol.

c.     Penyiapan Gel

Gel dibuat berdasarkan Suranto (2000, 2002) yaitu : penyiapan gel dimulai dengan merangkai cetakan gel, yaitu cetakan kaca yang dilengkapi spacer (pemisah) yang ditempatkan di belakang cetakan kaca yang berukuran lebih kecil. Cetakan kaca tersebut dipasang pada casting frame, selanjutnya dipasang pada casting stand.

Pembuatan gel dengan mencampurkan 20 ml larutan stock B dan 40 ml larutan stock A. kemudian campuran itu dipasangkan pada Buchi rotary evaporator selama 5 menit. Kemudian ditambahkan dan dicampurkan  dengan 0.04 ml dari N, N, N', N'-tetramethyl-ethylenediamine. Untuk mempolimerasi gel perlu dilakukan penambahan dan percampuran 0,06 gram ammonium persulphate sebelum larutan dituangkan kedalam cetakan pada BIO-RAD Mini PROTEAN 3.

Setelah stacking gel dituang di atas gel pemisah, sisir dipasang. Setelah terbentuk gel, sisir dilepas dari cetakan. Gel yang terbentuk dipindahkan ke clamping frame dan dimasukkan ke dalam buffer tank  lalu diisi dengan running buffer sampai terendam.

d.    Ekstraksi dan Penyiapan Sampel

Sampel yang digunakan adalah daun cabai yang berumur 6-8 minggu setelah tanam. Masing-masing daun tersebut ditimbang sebanyak 100 mg lalu ditumbuk hingga hancur menggunakan mortar lalu ditambahkan dengan buffer ekstraksi dengan perbandingan 1:5 untuk pewarnaan peroksidase, 1:3 untuk pewarnaan esterase dan 1:3 untuk acid phosfatase, (Suranto, 2000, 2002), kemudian dimasukkan ke dalam tabung effendorf dan disentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 20 menit. Larutan supernatan digunakan untuk proses elektroforesis.

e.     Elektroforesis

Elektroforesis dalam penelitian ini mengacu pada metode yang dilakukan oleh Suranto (2000, 2002). Dalam penelitian ini alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah satu set alat elektroforesis BIO-RAD Mini PROTEAN 3 tipe vertikal made in USA.

Supernatan diambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 7 µl untuk pewarnaan peroksidase dengan ditambahkan 3 µl loading dye, sedangkan untuk pewarnaan esterase dan acid phosfatase, 15 μl supernatan diambil dengan ditambahkan 3 μl loading dye. Sampel kemudian dielektroforesis dengan tegangan listrik konstan 85 volt selama kurang lebih 90 menit. Elektroforesis diakhiri apabila penanda warna bromphenol blue mencapai sekitar 56 mm dari slot ke arah anoda. Gel yang telah selesai running dipindahkan ke cawan pewarnaan untuk diwarnai dengan enzim pewarna.

f.     Pewarnaan

Pewarnaan pada penelitian ini menggunakan tiga sistem enzim, yaitu esterase , peroksidase dan acid phosfatase. Untuk membuat larutan pewarna, komposisi larutan yang digunakan disiapkan menurut Suranto (2000, 2002), yaitu sebagai berikut:

1)    Pewarnaan Esterase

Sebanyak 0,0125 gram -naftil asetat dimasukkan dalam cawan pewarnaan dan dilarutkan dengan 2,5 ml aseton, kemudian ditambahkan 50 ml dari 0,2 M buffer phosphat pH 6,5 dan 0,0125 gram fast Blue BB salt. Gel yang telah dielektroforesis dikeluarkan dan dimasukkan dalam larutan pewarna tersebut. Gel diinkubasi pada suhu kamar selama minimal 120 menit sambil digoyang secara perlahan-lahan setiap 10 menit. Setelah muncul pita-pita, pewarna dibuang dan dibilas dengan akuades, kemudian gel diambil gambarnya dengan kamera digital.

2)    Pewarnaan Peroksidase

Dalam cawan pewarnaan, sebanyak 0,0125 gram O-dianisidin dilarutkan dalam 2,5 ml aseton lalu ditambahkan 50 ml buffer asetat pH 4,5 dan 2 tetes hidrogen peroksida. Gel yang telah dielektroforesis dimasukkan dalam larutan pewarna dan diinkubasi selama 10 menit sambil digoyang secara perlahan-lahan setiap 2 menit. Setelah muncul pita-pita, pewarna dibuang dan dibilas dengan akuades, kemudian gel diambil gambarnya dengan kamera digital.

3)    Pewarnaan Acid Phosfatase

Dalam cawan pewarnaan dicampurkan 0,0125 gram -naftil fosfat ke dalam 2,5 ml aseton kemudian ditambahkan 75 ml buffer asetat dengan konsentrasi 0,2 M dan 0,025 gram Fast Black K Salt serta 0,025 gram fast garnet GBC Salt.

D.   Analisis Data

1.    Data Morfologi

Data analisa morfologi tanaman cabai (Capsicum Annum L) yang diperoleh ditabulasikan untuk menghasilkan data kualitatif dan kuantitatif berdasarkan variabel untuk masing-masing varietas yang diamati. Data kuantitif tersebut kemudian diubah menjadi data biner dengan diberi nilai 0 untuk fenotif yang tidak muncul (ciri morfologi yang tidak ada) dan nilai 1 untuk fenotif yang muncul (ciri morfologi yang ada).

2.    Data Anatomi

Hasil pengamatan tanaman cabai (Capsicum Annum L) yang diperoleh berdasarkan anatomi daun, pucuk dan batang, preparat difoto secara mikroskopis, kemudian disajikan dalam bentuk gambar dan hasilnya dibandingkan secara deskriptif antara sampel satu dengan yang lain yang diambil dari beberapa lokasi yang berbeda.

3.    Data Pola Pita Isozim

Analisis dilakukan secara kualitatif yaitu muncul tidaknya pita pada gel, bila muncul/teramati/terdeteksi diberi tanda (+) dan bila tidak muncul/tidak teramati/ tidak terdeteksi diberi tanda (-). Metode kuantitatif ditentukan berdasarkan nilai Rf (nilai pergerakan relatif perbandingan jarak migrasi pita terhadap jarak migrasi loading dye).

Nilai Rf ditentukan dengan persamaan dibawah ini (Rothe, 1994).:

Jarak migrasi pita

Rf : -----------------------------------

   Jarak migrasi loading dye