Purifikasi

Jika kita sudah dapat mendeteksi hasil PCR (lihat postingan sebelumnya), maka langkah selanjutnya adalah melakukan isolasi (purifikasi) produk PCR tersebut. Hal ini penting agar DNA (gene of interest) tersebut terbebas dari molekul-molekul lainnya seperti sisa-sisa buffer, dNTPmix, primer, dan lain-lain.

Ada cara konvensional (cara lama), dan ada cara baru (memakai kit). Dan karena saat ini kit PCR Product Purification sudah banyak dijual di pasaran, maka kali ini saya cuman akan membahas dengan cara baru. Caranya adalah loading seluruh produk PCR pada gel elektroforesis, kemudian iris hanya bagian yang ada DNA-nya (misalnya berukuran 450 bp). Setelah itu masukkan dalam e-tube, timbang gel yang telah dipisahkan tersebut dan catat berapa beratnya. Setiap kit dilengkapi dengan Solubilization Buffer (SB) dan Washing Buffer (WB), serta tube yang dilengkapi filter. Setelah ditimbang, maka tambahkan 3x volume SB, inkubasi e-tube pada suhu 50 derajat celsius selama 10 menit. Goyang e-tube tiap 3 menit untuk lebih cepat melarutkan gel. Setelah semua gel larut dalam SB, maka sentrifus 1 menit. Washing DNA dengan WB, dan sentrifuse sekali lagi. Tahap selanjutnya adalah pengeringan, yaitu dengan cara melakukan sentrifus sekali lagi. Dan tahap akhirnya adalah pelarutan (dilution) DNA dengan air steril atau Elution Buffer (EB) sebanyak 20-50 ul. Sentrifus sekali lagi dan tampung DNA murni tersebut dalam e-tube baru. Untuk lebih meyakinkan hasil purifikasi, bisa juga dicek 2-3 ul dalam gel elektroforesis.