Isozym SDS-PAGE

C.     METODOLOGI

1.   Waktu dan Tempat

Pratikum ini dilaksanakan pada hari Kamis, 29Desember 2012 di Lab III, Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2.   Alat dan Bahan

a)      Koleksi daun kecambah

Bahan : air dingin dan es batu

Alat : gunting tanaman, kantung plastik, dan termos es, lemari pendingin bersuhu 4^o C

b)      Pembuatan buffer

1)      Tank buffer

Bahan : boric acid (asam boraks), boraks, dan aquades

2)      Buffer ekstraksi sampel

Bahan : sistein, asam askorbat, sukrosa, boraks buffer pH 8,4

3)      Running buffer

Bahan : TAE (tris-acetic-acid-EDTA) 50x

c)      Pembuatan larutan stok

1)      Larutan M

Bahan : Tris, SDS, HCL, dan akuabides

2)      Larutan N

Bahan : Akrilamid, bisakrilamid, dan akuabides

3)      Loading dye

Bahan : Gliserol, bromphenol blue, dan akuades

d)     Pembuatan gel

1)      Gel pemisah

Bahan : TEMED, APS, iso-butanol, dan akuades

2)      Stacking gel

Bahan : TEMED, APS, dan akuades

e)      Ekstraksi daun atau kecambah

Alat : cawan porselen, Kristal es, dan sentrifius

f)       Pelaksanaan elektroforesis

Alat : Mortar, cawan porselen, thermometer, sentrifius, mikropipet, timbangan analitik, pipet volumetri, gelas ukur, gelas beker, elenmeyer, slot dengan 10-14 sumuran, nampan plastik, penunjuk waktu, dan apparatus elektroforesis mini vertical slab cell BIO-RAD USA model Protean III

g)      Pembuatan pewarna isozim

1)      Peroksidase 

Bahan : O-dianisidine, aseton, buffer asetat, dan H₂O₂,

2)      Esterase

Bahan : α-naphthyl asetat, aseton, 0,2 M buffer phosphate pH 6,5 serta fast blue BB salt

3.   Cara kerja

a)      Koleksi daun/kecambah

Sampel daun diperoleh dari 10 individu kecambah, dengan penampilan, umur, dan ukuran yang relatif seragam. Daun kecambah yang belum digunakan disimpan pada lemari pendingin bersuhu 4^oC.

b)      Pembuatan buffer

1)      Tank buffer

Melarutkan 14,4 g asam boraks dan 31,5 g boraks ke dalam akuades hingga mencapai volume 2 liter.

2)      Buffer ekstraksi sampel

Melarutkan 0,018 g sistein, 0,021 g asam askorbat, dan 5 g sukrosa (PA) ke dalam 20 ml boraks buffer pH 8,4. Perbandingan antara buffer ekstraksi dengan sampel daun/kecambah adalah 4:1, dalam satuan µl buffer ekstraksi dan µg sampel daun/kecambah.

3)      Running buffer

Mengencerkan TAE 50x sampai konsentrasi 1x

c)      Pembuatan larutan stok

1)      Larutan “M” : melarutkan 9,08 g Tris dan 0,6 g SDS ke dalam 140 ml akuabides, diatur sampai pH 6,8-7,0 dengan penambahan HCL, lalu ditambahkan akuabides hingga volumenya 150 ml.

2)      Larutan “N” : melarutkan 175,2 g akrilamid dan 4,8 g bisakrilamid ke dalam 400 ml akuabides dan volumenya dibuat hingga 600 ml.

3)      Loading dye : melarutkan 250 µl gliserol ditambah 50 µl bromphenol blue ke dalam 200 µl aquades.

d)     Pembuatan gel

Penyiapan cetakan gel dimulai dengan merangkai cetakan gel, yaitu cetakan kaca yang dilengkapi dengan spacer yang ditempatkan di belakang cetakan kaca yang berukuran lebih kecil. Cetakan kaca tersebut dipasang pada casing frame, selanjutnya dipasang pada casing stand. Untuk membuat discontinuous gel 12,5 % bahan yang dicampur adalah :

1)      Stacking gel

1,9 ml larutan “M”; 1,15 ml larutan “N”; 4,5 ml H₂O; dan 5 µl TEMED, dicampurkan pada 10 µl APS (baru) konsentrasi 10%. Setelah stacking gel dituang di atas gel pemisah, sisir dipasang. Apabila telah terbentuk gel, sisir dilepas dari cetakan. Gel yang telah terbentuk dipindahkan ke clamping frame dan dimasukkan ke dalam buffer tank, diisi dengan running sampai terendam.

e)      Ekstraksi daun kecambah

Memasukkan jaringan segar daun kecambah ke dalam buffer ekstraksi, dengan perbandingan 1:4 (w/v), yaitu 68 µg (0,068 g) sampel daun/kecambah dilumatkan dalam 272 µl (0,272 ml) buffer ekstraksi. Lalu digerus dalam cawan porselen yang diletakkan di atas serpihan-serpihan Kristal es, agar tetap dingin (suhu 4^oC), lalu direndam dalam serutan Kristal es. Supernatan yang terbentuk segera di masukkan dalam slot gel elektroforesis.

f)       Pelaksanaan elektroforesis

Mengambil supernatan sampel dengan menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl dan dengan ditambah loadingdye dan dibantu sample loading guide, sampel tersebut ditempatkan pada gel yang telah tercetak. Lalu sampel dielektroforesis awal dengan menggunakan tegangan 200 volt, 60 mA, selama 5 menit sampai sampel memasuki gel pemisah. Kemudian sampel dielektroforesis lanjutan dengan tegangan listrik konstan 150 V, 400 mA, selama 60 menit. Elektroforesis diakhiri apabila penanda warna bromofenol biru mencapai sekitar 56 mm dari slot kearah anoda. Setelah itu gel dipindah ke nampan plastik dan diwarnai dengan enzim pewarna.

g)      Pembuatan warna

Pola pita isozim dideteksi menggunakan dua sistem enzim yaitu peroksidase (PER) dan Esterase. Langkah pembuatannya yaitu :

1)      Peroksidase

Memasukan O-Dianisidine sebanyak 0,0125 g ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 2,5 ml aseton, lalu ditambahkan 50 ml 0,2 M buffer asetat pH 4,5 kemudian ditambahkan 2 tetes H₂O₂. Gel yang telah dielektroforesis direndam dalam larutan pewarna selama ± 10 menit sambil digoyang perlahan-lahan setiap 2 menit. Setelah pola pita muncul, pewarna dibuang dan dibilas dengan aquades. Gel direkam gambarnya dan difoto.

2)      Esterase

Melarutkan 0,00625 g α-naphthyl asetat kedalam 1,25 mL aseton pada sebuah cawan, kemudian ditambahkan 25 mL dari 0,2 M buffer phosphate pH 6,5 dan 0,00625 g fast blue BB salt. Gel yang telah dielektroforesis dimasukkan dalam larutan pewarna tersebut dan diinkubasi selama 10 menit sambil digoyang secara perlahan-lahan setiap 2 menit. Setelah pita-pita yang muncul terdeteksi lalu pewarna dibuang dan dibilas dengan aquades. Kemudian gel dapat direkam gambarnya dengan foto, scanner atau digambar dengan tangan.

4.   Analisis data

Data yang diperoleh dianalisis secara kualitatif yaitu berdasarkan muncul tidaknya pita pada gel dan metode kuantitatif berdasarkan tebal tipisnya pita yang terbentuk. Keragaman pola pita ditentukan berdasarkan nilai Rf, merupakan nilai pergerakan relatif yang diperoleh dari perbandingan jarak migrasi protein atau isozim terhadap jarak migrasi loading dye. Pita yang muncul diberi nilai 1, sedangkan yang tidak diberi nilai 0, lalu dibuat dendrogram hubungan kekerabatannya dengan analisis klaster. Model perhitungan pengelompokkan ini tercakup dalam UPGMA, yang dikomputasikan dalam program NTSYS versi 1.80.