Terimakasih Atas Kunjungan di Blog Saya. Silahkan Copy Paste dan Jangan Lupa di Kasih Kritik dan Saran.
Ekstraksi dan purifikasi DNA pada dasarnya merupakan serangkaian proses pemisahan DNA dari komponen – kompone sel lainnya. Ekstraksi DNA pada organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion), dan pengendapan DNA (precipitation) dan pemanenan. Saat ini secara teknis menjadi lebih simple dengan munculnya berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi dalam bentuk kit.
Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethylenediamine tetraacetic), SDS (Sodium dodecyl sulphate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis detergent yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan chloroform digunakan untuk membersihkan sisa – sisa protein dan dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.
Prinsip dasar di atas diaplikasikan dengan berbagai macam tahapan ekstraksi dan purifikasi DNA dengan berbagai modifikasi disesuaikan dengan kebutuhan atau jenis sample yang diekstraksi.
A. EKSTRAKSI DAN PURIFIKASI DNA DARI JARINGAN TUBUH
Kegiatan yang dilakukan pada prinsipnya dikelompokkan menjadi 3 kelompok kegiatan yaitu : penyiapan larutan, proses ekstraksi dan proses purifikasi.
A.1. Larutan yang harus dipersiapkan
Larutan yang perlu disiapkan dapat dilihat sebagai berikut (klik disini)
A.2. Tahapan Kerja Ekstraksi :
- 30 mg sampel dipotong – potong dan digerus dengan mortar hingga halus dan masukkan sampel yang telah digerus pada tabung ependorf 1.5 ml yang berisi 500 µl buffer TEN / STE, kemudian vortex.
- Tambahkan 20 µl proteinasi K (10 mg/µl) dan 50 µl 10% SDS, vortex. Kemudian goyang di 'shaking water bath' pada temperatur 55 oC selama 2 jam.
- Tambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putar pelan – pelan pada temperatur ruang selama 1.5 jam. Kemudian sentrifugasi 300 rpm selama 5 menit.
- Pindahkan supernatant ke tabung baru, tambahkan 50 µl 5 M NaCl dan 1 ml ethanol absolute, kocok dengan tangan. Inkubasi di freezer selama 1 jam.
- Sentrifugasi 8000 rpm selama 5 menit, kemudian buang cairannya.
- Tambahkan 1 ml ethanol 70%, kemudian sentrifugasi lagi 8000 rpm selama 5 menit.
- Buang larutan dan tiriskan hingga tidak ada larutan tertinggal.
- Keringkan sisa – sisa ethanol dengan aspirator selama 30 – 60 menit.
- Tambahkan 50 µl TE dan simpan di temperatur 4 oC sampai digunakan.
- Tabung berisi 50 µl DNA hadil ekstraksi ditambah 5 µl RNAase (10 mg/ml), vortex, dan inkubasi pada temperatur 37 oC selama 3 jam.
- Tambahkan 200 µl air distilasi (steril), 200 µl phenol, 200 µl chloroform dan goyang pelan – pelan dengan tangan, dan kemudian sentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit
- Pindahkan supernatant ke tabung baru
- Tambahka 25 µl 5 M NaCl, 500 µl ethanol absolute dingin dan inkubasi pada suhu -20 oC selama 1 jam.
- Sentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit, buang larutan dan tiriskan hingga semua larutan terbuang
- Tambahkan 50 µl air milliQ dan simpan di suhu ruang sampai digunakan. Jika akan digunakan pada hari berikutnya disimpan pada temperatur 4 oC.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar