Terimakasih Atas Kunjungan di Blog Saya. Silahkan Copy Paste dan Jangan Lupa di Kasih Kritik dan Saran.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Pendahuluan
PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA-target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan direplikasi. PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Muladno 2002).
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA cetakan, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase. PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponen‐komponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Beberapa komponen yang penting yang dalam reaksi PCR adalah DNA target, primer, enzim Taq polymerase, deoksinukleoside triphosphat (dNTP) dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup (Barnum 2005).
Tujuan
Mengetahui cara perbanyakan DNA dengan PCR.
Metode
Diambil 1 koloni bakteri hasil transformasi dalampetrydisk kemudian dimasukkan ke dalam tabung effendorf yangberisi 6µl ddH2O, setelah itu dipanaskan pada suhu 95ºC selama 10 menit. Sampel kemudian diinkubasi dalam es selama 2-5 menit, kemudian dilakukan PCR koloni. Sebanyak 5µl komposisi PCR koloni yang telah dimix dengan 0,3 µl primer L1 dan 0,3µl primer L2, langkah selanjutnya adalah memasukkan dalam mesin PCR, selama dalam mesin PCR dilakukan pradenaturasi pada suhu 95ºC selama 5 menit, berlanjut terjadinya denaturasi selama 5 menit, proses annealingpada suhu 52ºC selama 30 menit, kemudian extension 72ºC selama 2 menit dan proses akhir selama 10 menit.
Hasil pengamatan
Pembahasan
PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Teknik ini merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Dalam sistem kerjanya, PCR dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA merupakan double helix, yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan antiparalel antara satu dengan yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terbentuk antara basa-basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A) dengan Thymine (T), dan Guanine (G) dengan Cytosin (C) (Muladno 2002).
PCR memiliki beberapa komponen, diantaranya yaitu enzim Taq polymerase, primer, dNTP dan buffer. EnzimTaq polymerase memiliki keaktifan dalam suhu tinggi, oleh karena itu penambahan enzim tidak perlu dilakukan dalam setiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin. Pemakaian Taq polymerase dalam konsentrasi yang terlalu besar akan mengakibatkan munculnya background produk non-spesifik. Sebaliknya, bila konsentrasi Taq polymerase terlalu rendah, maka proses amplifikasi berlangsung secara inefisien, dan produk amplifikasi yang diperoleh akan mempunyai konsentrasi yang relatif rendah. Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Fungsi dari primer yaitu menghindari adanya polipurin atau polipirimidin dan menghindari adanya struktur sekunder. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel dan mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut menentukan keberhasilan reaksi PCR. dNTP sebagai penyusun DNA yang baru yang terdiri atas 4 macam, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer untuk mengkondisikan reaksi agar PCR berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase (Innis et al. 1990).
Terdapat beberapa tahapan dalam PCR yaitu pradenaturasi, denaturasi, annealing dan extension. Pradenaturasi dilakukan diawal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase. Selama proses denaturasi double strandedDNA akan membuka menjadi single stranded DNA. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan. Pada proses annealing primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan primernya dan ikatan hidrogen akan terbentuk dan suhu. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya. Sedangkan pada proses extension primer yang telah menempel akan mengalami perpanjangan dengan dNTP yang komplemen pada sisi 3’. Seandainya ada 1 copy gene sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4 dan seterusnya. Perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial (Gaffar 2007).
Berdasarkan hasil PCR, sebagian besar kelompok termasuk kelompok kami berhasil melakukan teknik PCR koloni karena terdapat pendaran. Sedangkan hanya beberapa kelompok yang tidak berhasil. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR koloni yaitu teknik aseptik yang digunakan baik sehingga pendaran dapat muncul yang menandakan PCR koloni berhasil.
Simpulan
PCR merupakan teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Terdapat beberapa komponen dalam PCR diantaranya enzim Taq polymerase, primer, dNTP dan larutan penyangga (buffer). Sedangkan beberapa tahap dalam PCR yaitu pradenaturasi, denaturasi, annealing dan extension. Kelompok kami berhasil melakukan teknik PCR koloni karena terdapat pendaran.
Daftar pustaka
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA: Thomson Brooks.
Gaffar S. 2007. Penggunaan PCR (Polymerase Chain Reaction) untuk deteksi retrovirus HTLV (Human T-cell Lymphotropic Virus) [tesis]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran.
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White JT. 1990. PCR Protocols, A guide to Metods and Applications. Sanm Diego: Academic Press Inc.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar